Chương 1
1
CÔNG NGHỆ ENZYME
(Enzyme technology
Technologie des enzymes
Enzymtechnologie)
Người trình bày:
Bùi Văn Ngọc
Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm
KH&CN Việt Nam
Email: [email protected] hoặc [email protected]
Hà Nội, tháng 8 năm 2016
2
QUAN ĐIỂM
• Cùng xây dựng kiến thức
• Chỉ nên tin một nửa
• Không có câu trả lời sai
• Chia sẻ
• Cởi bỏ
3
Bài mở đầu
• Công nghệ enzyme là gì?
• Sơ lược lịch sử nghiên cứu và ứng dụng enzyme
• Vai trò của công nghệ enzyme trong công nghệ thực phẩm
• Vai trò của công nghệ sinh học (công nghệ gen, DNA tái tổ
hợp) đối với công nghệ enzyme
4
Công nghệ enzyme là gì?
Enzyme là gì?
• Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein
• Thúc đẩy, xúc tác, chuyển hoá trong các phản ứng hoá học,
hoá sinh học
• Đặc hiệu đối với cơ chất xúc tác hoặc chuyển hoá
Công nghệ Enzyme (Công nghệ sinh học Enzyme)
và Ứng dụng của chúng
5
Sơ lược lịch sử nghiên cứu và ứng dụng
enzyme
• Enzyme trong thời kỳ cổ đại: Các bản viết cổ đã minh chứng,
khoảng năm 2100 trước công nguyên tại Babilon, Hy Lạp, Ai
cập cổ đại, enzyme đã được sử dụng vào:
- Lên men rượu
- Sản xuất giấm thông qua việc chuyển hoá rượu thành acid acetic
- Sản xuất Pho mát từ sữa (dự trữ, bảo quản)
- Làm bánh mì thông qua việc sử dụng nấm men
- Làm mềm thịt thông qua việc sử dụng nước ép từ quả đu đủ
Thời kỳ này chưa có nghiên cứu và hiểu biết sâu về enzym, việc sử dụng enzyme mang tính kinh nghiệm thuần tuý, tín ngưỡng
6
• Thế kỷ 17 đến đầu thế kỷ 18:
- Vanhemont (Hà Lan) đã đưa ra khái niệm về quá trình lên men trong sản xuất rượu, bánh mỳ khi quan sát sự tạo thành bọt khí, chất khí khác không khí trong quá trình lên men
- Silvius (Basse Guyenne) lần đầu tiên nêu lên rằng tất cả các quá trình sống đều là các quá trình hoá học, hoá sinh học
Quan sát thực nghiệm, hiện tượng, chưa tìm hiểu, giải thích được bản chất, cơ chế.
• Nửa cuối thế kỷ 18: Đã có những thí nghiệm đầu tiền về enzyme
- Reaumur (Pháp) và Spal anzani (Ý) đã thí nghiệm in vitro, nghiên cứu khả
năng tiêu hoá thịt trong dạ dày của động vật và người. Qúa trình tiêu hoá phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian, và lượng dịch dạ dày.
- Schwann (Đức) đã gọi chất tiêu hoá thịt là pepsin
Các nghiên cứu này đã tạo tiền đề cơ sở cho cho nghiên cứu
có hệ thống tiếp theo
7
• Trong thế kỷ 19:
- Kiêc gôp (Nga), năm 1814, chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hoá tinh bột thành đường ở nhiệt độ 40ºC –
60ºC
- Payen (Pháp), năm 1833, đầu tiên phát hiện enzyme diastase ("phân giải", Hy lạp) để chỉ một hoặc một nhóm enzyme tham gia vào quá trình phẩn giải tinh bột thành đường maltose
- Louis Pasteur (Pháp) khi nghiên cứu quá trình lên men đường thành rượu bởi nấm men đã kết luận rằng quá trình này chỉ xảy ra trong tế bào nấm men sống
- Leuchs (Đức), năm 1851, đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành đường
- Kühne (Đức), năm 1877 lần đầu dùng thuật ngữ enzyme (chất men) và
"lên men" dùng để chỉ quá trình chuyển hoá hoá học bởi vi sinh vật sống.
Phát hiện một enzyme tham gia vào quá trình tiêu hoá khác là trypin (ruột non).
- Buchner (Đức), năm 1897, đã chứng minh rằng quá trình lên men vẫn diễn ra khi bổ sung dịch chiết nấm men (không có tế bào nấm men sống) hay enzyme vẫn hoạt động dù bị tách khỏi tế bào sống. Ông đặt tên enzyme tham gia vào qúa trình lên men đường là "zymase". Năm 1907, ông đã nhận giải thưởng Nobel cho phát hiện này.
8
• Nửa đầu thế kỷ 20
- Tranh luận giữa các nhà khao học về việc hoạt tính của enzyme có liên quan đến protein? Protein bản thân nó không có khả năng xúc tác? Hay protein chỉ đơn thuần là một một thành phần phụ của một "enzyme thực". Một enzyme có các thành phần nào?...
- Henri (Pháp), năm 1903, phát hiện rằng các phản ứng enzyme được bắt đầu bởi sự tương tác giữa enzyme và cơ chất
- Harden và Young (Anh), năm 1906, đã phát hiện được coenzyme
- Sorensen (Đan Mạch), năm 1909, nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme
- Michaelis (Đức) và Menten (Canada), năm 1913, nghiên cứu động học và cơ
chế phản ứng enzyme. Đưa ra mô hình toán học của phản ứng
- Bayliss (Anh), năm 1919, nghiên cứu động học phản ứng enzyme
- Sumner (Mỹ), năm 1926, cho biết enzyme urease là protein tinh khiết và đã kết tinh được enzyme này. Năm 1937, ông cũng kết tinh được enzyme catalase
- Sumner, Northrop, Stanley (Mỹ), năm 1930, kết luận enzyme là protein tinh khiết khi nghiên cứu về enzyme hệ tiêu hoá pepsin, trypsin, chymotrypsin.
Năm 1946 ba nhà khoa học này nhận giải Nobel về hoá học
- Lineweaver và Burk (Mỹ), năm 1934, biểu diễn mô hình Michaelis-Menten dưới dạng tuyến tính (hồi quy tuyến tính)
- 20 năm sau, khoảng 130 enzyme đã được kết tinh, nhờ đó cấu trúc phân tử
của enzyme đã được xác định bằng phương pháp tinh thể học tia X
- Mở ra một giai đoạn mới, một bước ngoặt trong nghiên cứu về enzyme
9
• Nửa cuối thế kỷ 20: Một số thành tựu
- Xác định cấu trục bậc I của phân tử enzyme. Nghiên cứu mối quan hệ
giữa cấu trúc và chức năng của phân tử enzyme.
- Phân loại và định danh (gọi tên) enzyme một cách hệ thống
- Phát hiện các enzyme giới hạn (restriction enzyme, restrictase)
- Năm 1968, enzyme ribonuclease lần đầu tiên được tổng hợp hoá học bằng cách gắn lần lượt từng amino acid hoặc nối các đoạn peptid (một chuỗi amino acid)
- Phát hiện enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase)
- Phát hiện một số phân tử sinh học có hoạt tính xúc tác giống enzyme: kháng thể, ribozyme
- Sản xuất được các enzyme không tan
- Đã tạo được các enzyme tái tổ hợp (recombinant enzyme) có hoạt độ
cao, tính năng mới mong muốn (bền nhiệt, chịu pH...)
10
• Hiện nay và trong tương lai:
- Thu nhận, sản xuất enzyme từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, có hoạt độ cao, đặc tính mới (bền nhiệt, chịu pH...) bằng công nghệ gen (DNA tái tổ hợp, kỹ thuật di truyền, proteomics)
- Tối ưu hoá quá trình sản xuất enzyme
- Hiểu rõ được môi liên quan đến cấu trúc, chức năng, cơ chế điều hoà, biểu hiện protein trong phân tử hoặc hệ thống enzyme
- Mô hình hoá phân tử, hệ thống enzyme trong tế bào, cơ thể sống.
Nghiên cứu các dạng tồn tại, vai trò, chức năng, mối quan hệ của enzyme trong quá trình sinh hoá, sinh lý, trao đổi chất tế bào và trong toàn bộ cơ thể sống
- Tạo ra nhiều enzyme thế hệ mới ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm, công nghiệp...
11
Vai trò của enzyme trong công nghệ thực
phẩm (bảo quản và chế biến)
"Without enzyme there can be no life"
• Tăng tốc độ phản ứng (102 – 1010 lần)
• Kiểm soát được thời gian phản ứng
• Làm tăng giá trị cảm quan, cấu trúc, mùi vị của sản phẩm
• Kéo dài tuổi thọ của sản phẩm
• Hạn chế, làm giảm việc sử dụng các chất phụ gia hoá học
trong bảo quản và chế biến sản phẩm
• Khắc phục khiếm khuyết tự nhiên, không đồng đều của
nguyên liệu: Ví dụ
- Bổ sung amilase vào malt đại mạch chất lượng kém nhằm chuyển hoá hết tinh bột thành dextrin, đường lên men trong qúa trình sản xuất bia
- Bổ sung pectinase trong qúa trình chế biến một số loại quả (cà chua) có độ chín khác nhau nhằm tăng hiệu suất chiết dịch quả
12
Nội dung trình bày
• Chương 1: Enzyme – chất xúc tác sinh học
• Chương 2: Sản xuất chế phẩm enzyme từ vi sinh vật
• Chương 3: Sản xuất enzyme thực vật và động vật
• Chương 4: Enzyme cố định (immobilized enzymes)
• Chương 5: Một số enzyme chủ yếu và ứng dụng chúng
trong chể biến thực phẩm
• Chương 6: Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất và
cải biến enzyme
13
Chương 1: Enzyme – chất xúc tác sinh học
1.1. Khái niệm chunng
1.2. Cấu tạo hoá học
1.3. Cơ chế tác động
1.4. Tính đặc hiệu
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme
1.6. Phân loại và danh pháp enzyme
1.7. Các phương pháp nghiên cứu enzyme
14
1.1. Khái niệm chung
• Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein thường
có phân tử lượng từ 10 nghìn – 1 triệu dalton, được cơ thể
hoặc tế bào tổng hợp và tham gia vào các phản ứng hoá sinh
học.
• Enzyme không đi qua được màng bán thấm?
• Enzyme không bị mất đi trong quá trình phản ứng
• Enzyme có tính đặc hiệu đối với từng loại phản ứng và cơ
chất hoặc chất tham gia phản ứng
• vsđgå
15
1.2. Cấu tạo hoá học (các thành phần cấu
trúc của phân tử enzyme)
• Vì sao cần nghiên cứu cấu trúc và thành phần cấu tạo của
enzyme?
- Hiểu được bậc cấu trúc hay cấu hình không gian của phân tử enzyme (bậc 1, 2, 3, 4)
- Hiểu được tính kỵ/ưa nước, tính tan của enzyme (protein của enzyme)
- Hiểu được mối quan hệ giữa các thành phần cấu trúc và chức năng của enzyme
• Thành phần cấu tạo
- Enzyme một thành phần (một cấu tử): là phân tử protein đơn giản bao gồm một chuỗi các amino acid (axit amin)
- Enzyme hai thành phần (hai cấu tử): là phân tử protein phức tạp. Trong đó, phần protein được gọi là apoenzyme (hay apoprotein), phần còn lại gọi là nhóm ngoại cofactor. Các cofactor có thể là các hợp chất vô cơ, các ion kim loại hoặc có thể là hợp chất hữu cơ (coenzyme). Phức hợp bao gồm cofactor và apoenzyme được gọi là holoenzyme (haloenzyme)
16
Thành phần cấu tạo của enzyme
Enzyme đơn giản
Enzyme phức tạp
• Cofactor vô cơ (inorganic): Phức hợp Fe-S hoặc các ion kim
loại, Fe, Mn, Cu, Ca, Zn.
• Cofactor hữu cơ (organic): coenzyme như flavin (FAD),,
nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), NADP hoặc các
nhóm phụ gia (prosthetic group) như heme, biotin
17
Cofactor
Hữu cơ
Vô cơ
Coenzyme (liên kết hydro
lỏng lẻo, thuận nghịch với
Các ion kim loại (liên kết
enzyme và được giải
bền vững với enzyme)
phóng khỏi vị trí xúc tác
Nhóm phụ gia (liên kết
của enzyme trong qúa
- Fe (liên kết oxy, vận
chặt chẽ bằng liên kết
trình phản ứng ):
chuyển electron)
đồng hoá trị với enzyme):
- FAD (vận chuyển điện
- Ca (hoạt hoá cơ chất)
- Heme (vận chuyển điển
tử, oxy hoá-khử)
tử)
- Mg (liên kết cơ chất)
- NAD, NADP (vận
- Biotin (vận chuyển nhóm
- K (ổn định cơ chất)
chuyển điện tử, oxy hoá-
CO
- Zn (liên kết cơ chất và
khử)
2)...
ổn định cấu trúc enzyme)
- Coenzyme A (vận
...
chuyển nhóm acyl)...
18
Một số loại liên kết hoá học
• Liên kết hydro
DNA
Amino acid (protein
19
Một số loại liên kết hoá học
• Liên kết cộng hoá trị
20
Một số loại liên kết hoá học
• Liên kết ion
21
Một số loại liên kết hoá học
• Liên kết (lực) van der Waals
22
Sắp xếp theo độ bền liên kết
Liên kết (lực) van der Waals, ion, hydro, cộng hoá trị?
23
Một số loại liên kết hoá học trong phân tử
protein enzyme
24
Một số loại liên kết hoá học trong phân tử
protein enzyme
25
Trung tâm hoạt động của enzyme (active
site) bao gồm:
• Vị trí (vùng) gắn kết hay liên kết (binding site): Lựa chọn cơ
chất và gắn vào trung tâm hoạt động
• Vị trí xúc tác (catalytic site): Thực hiện vị trí xúc tác của
enzyme
Vị trí liên kết
Cơ chất
Vị trí xúc tác
26
Xác định vị trí gắn kết (binding site) và xúc tác (catalytic site) trong trung tâm hoạt động (active site) của enzyme?
Trung tâm hoạt động
Enzyme đơn giản
Enzyme phức tạp
• Vị trí xúc tác của enzyme đơn giản liên quan trực tiếp đến một vài amino acid trong trung tâm hoạt động
• Vị trí xúc tác của enzyme phức tạp có liên quan đến các cofactor (vô cơ, hữu cơ)
• Apoenzyme: có nhiệm vụ nhận diện cơ chất, quyết định tính đặc hiệu cơ chất
• Cofactor: có nhiệm vụ thực hiện chức năng xúc tác (hoạt tính xúc tác), quyết định loại phản ứng hoá học enzyme tham gia xúc tác
27
Các amino acid
cấu thành nên
phân tử protein
28
Các bộ ba mã hoá cho các amino acid
29
Sinh tổng hợp protein (mã hoá, sao chép, dịch mã)
Hoặc
30
Cấu trúc của enzyme
Cấu trúc bậc 1
Cấu trúc bậc 2
Cấu trúc bậc 3
Cấu trúc bậc 4
31
Quá trình hình thành cấu trúc của enzyme
Bậc cấu trúc
Quá trình hình thành
32
1.3. Cơ chế tác động
• Mô hình Fischer (1890, chìa khoá - ổ khoá) và Koshland
(1858, khớp cảm ứng)
33
1.3. Cơ chế tác động
• Sự kết hợp giữa enzyme (E) và cơ chất (substrate, S)
Enzyme đơn giản
Enzyme phức tạp
34
1.3. Cơ chế tác động
• Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (S). Các liên kết nào
được hình thành?
• Cơ chế tác động (tổng quát)
1.
Cơ chất tiếp xúc với trung tâm hoạt động
2.
Hình thành phức hợp enzyme cơ chất (cấu hình của các amino acid tại vị trí gắn kết cơ chất có thể thay đổi để phù hợp với hình dạng của cơ chất) 3.
Cơ chất được chuyển hoá
4.
Sản phẩm được giải phóng khỏi trung tâm hoạt động
5.
Enzyme bắt đầu phản ứng mới
35
Động học phản ứng enzyme (enzyme kinetics)
• Động học phản ứng enzyme một cơ chất (S)
(tự phát, tự xảy ra?)
(xúc tác enzyme )
36
Biến thiên năng lượng tự do Gibbs và chiều của phản ứng hoá
học
• Phương trình Gibbs của phản ứng hoá học
- ∆H: Thay đổi của enthalpy (kJ)
- T: Nhiệt độ (K, kelvin)
- ∆S: Thay đổi của entropy (kJ/K)
- Nếu ∆G < 0, phản ứng tự xảy ra (theo chiều thuận)
- Nếu ∆G = 0, phản ứng ở trạng thái cần bằng
- Nếu ∆G > 0, phản ứng khônd tự xảy ra
37
Biến thiên năng lượng hoạt hoá (activation energy, EA) trong phản ứng enzyme
k1 > k2
Không có enzyme
Có enzyme
38
Mô hình Michaelis - Menten
hay
• E: enzyme
• S: Cơ chất (substrate)
• ES: Phức hợp trung gian giữa E và S
• P: Sản phẩm (Product)
• k1–k4: Các hằng số vận tốc của phản ứng tương ứng
• kf, kr, kcat: Các hàng số vận tốc của phản ứng thuận (forward), nghịch (reverse), hằng số xúc tác (catalytic)
Nghiên cứu mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất (bị chuyển hoá)
hoặc sản phẩm tạo thành và tốc độ phản ứng
39
Mô hình Michaelis - Menten
• kcat (turnover number):
Số phân tử cơ chất cực
đại được chuyển hoá bởi
1 phân tử enzyme trong
một đơn vị thời gian
(giây)
Biến thiên (thay đổi) theo thời gian của
nồng độ cơ chất [S], [P], [E], [ES]
40
Phương trình Michaelis - Menten
v
[ S]
• v: Tốc độ phản ứng
• [S]: Nồng độ cơ chất
• Vmax: Tốc độ phản ứng cực đại tại nồng độ bão hoà cực đại của cơ
chất
• KM: Hằng số Michaelis, là nồng độ cơ chất tại đó tốc độ phản ứng (v) bằng ½ Vmax (KM cho biết ái lực giữa enzyme và cơ chất)
41
Phương trình Michaelis - Menten
• Nếu [S] < < KM, v=
, v phụ thuộc tuyến tính vào
[S] (động học bậc nhất)
• Nếu [S] > > KM, v=Vmax, vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc vào [S]. Nếu tiếp tục tăng [S], v cũng không tăng
theo
• Nếu [S] = KM, v= Vmax/2, vận tốc phản ứng bằng ½ vận tốc cực
đại, KM càng lớn ái lực giữa E và S càng nhỏ và ngược lại??
42
Đánh giá ái lực giữa enzyme và cơ chất,
hiệu suất xúc tác
[E][S]
= [ES]
k cat/ K M: Xác định hiệu suất chuyển hoá một cơ chất thành sản phẩm k r/ k f: Hằng số phân ly đối với phức hợp E và S
43
Xác định vận tốc cực đại (Vmax) và ái lực enzyme-cơ chất (KM)
• Phương trình Lineweaver–Burk
y = ax + b
44
Xác định vận tốc cực đại (Vmax) và ái lực enzyme-cơ chất (KM)
• Phương trình Eadie–Hofstee
y = - ax + b
45
Xác định vận tốc cực đại (Vmax) và ái lực enzyme-cơ chất (KM)
• Phương trình Hanes–Woolf
y = ax + b
46
Các bước xác định Vmax và KM thực nghiệm và bài tập thực hành
• Xác đính [S], đo vận tốc phản ứng (v) tương ứng với mỗi
nồng độ của S
• Tính 1/v, 1/[S]
• Vẽ đồ thị tuyến tính dạng y=ax+b, có trục tung y=1/v, trục
hoành x=1/[S]
• Xác định hệ số góc (dốc) a=KM/Vmax, hằng số (tung độ góc)
b=1/Vmax
• Tính KM và Vmax từ các tham số này
47
Xác định vận tốc cực đại (Vmax) và ái lực enzyme-cơ chất (KM)
• Phương pháp hồi quy phi tuyến tính (non-linear regression)
Tuyến tính
Phi tuyến tính
Tuyến tính
48
Phù hợp hay điều chỉnh (Fitting) phương trình thực nghiệm và
phương trình tính toán bằng hàm nls (R) hoặc solver (Excel) v
●
●
●
●
●
●
V'
●
max [ S']
●
v' =
●
K'm + [ S']
●
●
●
[ S]
v (thực nghiệm) ≈ v' (tính toán) hay v - v' ≈ 0: Xác định các trị số sao cho sai khác tổng bình phương (SS) là nhỏ nhất hay tối thiểu hoá khoảng cách các điểm nằm trên 2 đồ thị v (thực nghiệm) và v' (tính toán)
49
Động học phản ứng enzyme nhiều cơ chất
(Phần lớn các phản ứng enzyme có sự tham gia của 2 hay nhiều cơ
chất và tạo ra 2 hoặc nhiều sản phẩm)
• Cơ chế phản ứng kiểu tổ hợp hai hoặc ba (binary or ternary
complex)
E
A + B
P + Q
- Enzyme (E), cơ chất (A, B), sản phẩm (P, Q)
- Tổ hợp hai (binary): EA, EB, EP, EQ
- Tổ hợp ba (ternary): EAB, EPQ
50
Động học phản ứng enzyme nhiều cơ chất
• Cơ chế phản ứng kiểu ping-pong
E
A + B
P + Q
• Enzyme (E), enzyme dạng trung gian (E*, biến đổi hoá học)
• Cơ chất (A, B), sản phẩm (P, Q)
51
So sánh cơ chế phản ứng kiểu tổ hợp và ping pong
y1=a1x1 + b1
y2=a2x2 + b2
1
y3=a3x3 + b3
1
y1=a1x1 + b1
V
V
y
max
max
2=a2x2 + b2
1
1
-
-
y3=a3x3 + b3
Km
Km
Ví dụ: Glutathione S-transferases (khử
Ví dụ: Trypsin và chymotrypsin (hệ tiêu
độc)
hoá)
• Trong đó [A] cố định, [B] thay đổi
Bạn đang đọc truyện trên: truyentop.pro