PHẦN MỘT: TỔNG QUÁT VỀ ĐÔNG MÁU

Người ta gọi Cầm máu là toàn bộ hiện tượng xảy ra làm máu ngừng chảy sau khi mạch máu bị tổn thương. Có 3 giai đoạn được mô tả :

- Giai đoạn cầm máu sơ khởi hay tạo cục máu trắng liên hệ chính yếu đến tiểu cầu.

- Giai đoạn đông máu hay tạo cục máu đỏ bởi mạng fibrin bao quanh hồng cầu liên hệ chính yếu với các yếu tố đông máu.

- Giai đoạn tan sợi huyết làm tan cục máu đỏ, tái lập lưu thông tuần hoàn, liên hệ cấc yếu tố tan sợi huyết.

Cả 3 giai đoạn đông máu:

- Khi xảy ra theo sinh lý bình thường tạo hiện tượng cầm máu.

- Khi 1 trong 3 hiện tượng này bất thường thì tạo ra bệnh lý hoặc giảm đông có nguy cơ chảy máu, hoặc tăng đông, cục máu tạo ra trong hệ tuần hoàn có nguy cơ gây tắc mạch. Chảy máu và tắc mạch là hai khía cạnh bệnh lý đưa đến nhiều hậu quả trầm trọng cho đời sống.

I. Giai đoạn cầm máu:

Cầm máu là 1 quá trình tương tác giữa 3 yếu tố là: thành mạch, tiểu cầu và các protein dính để hình thành đinh cầm máu, ngăn chặn dòng máu tiếp tục chảy.

• Cơ chế cầm máu:

TỔN THƯƠNG THÀNH MẠCH

II. Giai đoạn đông máu:

-Đông máu là 1 cơ chế bảo vệ của cơ thể, chống lại tình trạng mất máu do tổn thương thành mạch. Ngay sau khi thành mạch bị tổn thương, mạch máu co lại và tiếp theo là các hiện tượng dính tiểu cầu vào vết thương, hoạt hóa và ngưng tập tiểu cầu. Những phản ứng này được gọi là quá trình cầm máu để tạo nên nút tiểu cầu.

Nút tiểu cầu nhanh chóng được củng cố bởi hệ thống sợi fibrin không tan nhờ cơ chế đông máu. Sự tạo thành fibrin là kết quả của 1 chuỗi phản ứng men liên quan đến các yếu tố đông máu huyết tương. Những phản ứng này xảy ra trên bề mặt tế bào nội mô, làm cho đông máu là 1 hiện tượng chỉ khu trú ở ngay vết thương thành mạch. Ngoài ra, hiện tượng hoạt hóa trở lại làm cho dòng thác phản ứng đông máu tự khuếch đại và cơ chế bảo vệ của cơ thể phát huy hết khả năng.

Quá trình đông máu được điều hòa tạo trạng thái thăng bằng.Nếu sự thăng bằng này bị phá vỡ,sẽ có nguy cơ chảy máu hay huyết khối.

*Cơ chế dông máu :

CON ĐƯỜNG NỘI SINH

kallikrein

HMWK Prekallikrein

XII XIIa

XI XIa Ca++

Ca++ PL

IX IXa VIIIa VIII

Ca++ PL

X Xa Va V

II IIa XIII

fibrinogen Fibrin(hòa tan) YTTC-VIIa XIIIa

Fibrin(không hòa tan)

YTTC-VII

CON ĐƯỜNG NGOẠI SINH

III. Giai đoạn tan sợi huyết:

-Tiêu fibrin là 1 quá trình sinh lý, nhằm giải quyết cục máu đông được tạo thành ở giai đoạn trước đó, tái lưu thông tuần hoàn. Tuy nhiên, hiện tượng này cũng thường xảy ra do nhiều cơ chế bệnh sinh khác nhau.

-Plasmin là 1 men tiêu đạm,các chất đệm gian bào,các tiền hormone và tiền cytokine. Ngoài ra,plasmin cũng giữ vai trò quan trọng trong quá trình tái tạo mô, sinh ung thư, viêm, thực bào, quá trình làm tổ của phôi,...

* Cơ chế tiêu fibrin: Plasminogen

Thác đông máu

Protein C (-) Chất ức chế hoạt hóa

Plasminogen PAI-1

Tổn thương t-PA

thành mạch'

Urokinase

Plasmin

(-) α2 antiplasmin

Thoái giáng các yếu tố V và VII α macroglobulin

Fibrin/fibrinogen sản phẩm thoái giáng

(FDPs)

PHẦN HAI : KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM ĐÔNG MÁU

I.DỤNG CỤ - THUỐC THỬ

1. Dụng cụ:

- Các ống nghiệm thủy tinh sử dụng trong xét nghiệm đông máu cần phải được chuẩn hóa, có kích thước hoàn toàn giống nhau(mọi thay đổi kích thước, hình dáng, độ dày của thành ống,... đều có thể làm thay đổi kết quả).

- Đối với các xét nghiệm liên hệ đến các yếu tố đụng chạm, liên hệ đến tiểu cầu nên sử dụng các ống nghiệm bằng nhựa vì khả năng không dính nước của nó sẽ không làm kích hoạt màng tiểu cầu.

• Cách rửa dụng cụ thủy tinh:

Các xét nghiệm đông máu đòi hỏi các dụng cụ rất sạch. Do đó việc rửa dụng cụ thủy tinh rất quan trọng đến chất lượng các kết quả:

+ Ngâm trong nước xà phòng.

+ Rửa lại bằng nước thường. Ngâm trong hỗn hợp Sulfochromic trong 1 đêm.

+ Rửa với thật nhiều nước để loại bỏ các vết acid.

+ Hấp và sấy khô. Dụng cụ bằng nhựa nên sấy ở nhiệt độ thấp.

- Có thể sử dụng các ống nghiệm có chất chống đông bán sẵn trên thị trưòng, dùng 1 lần.

1. Thuốc thử:

Một số thuốc thử thông dụng:

-Dung dịch chống đông citrate 3,8 %

-Dung dịch CaCl2 0,025M

- Đệm Michaelis( còn gọi là Owren Koller).

- Các thuốc thử sinh học(thrombo¬plastin, cephalin, yếu tố huyết tương và huyết thanh,...): có bán sẵn trên thị trường.

II LẤY MẪU

- Xét nghiệm đông máu không cần lấy vào lúc đói, chỉ cần ăn điểm tâm không có chất béo( mỡ, sữa). Trừ xét nghiệm đánh giá độ ngưng tập tiểu cầu, bệnh nhân phải nhịn đói qua đêm trước khi lấy máu.

- Phải lấy máu thật nhanh, gọn( tránh đông máu hoặc tiêu fibrin ). Sau khi cột garo, đâm vào một tĩnh mạch thật nhanh, gọn, tránh mò tĩnh mạch nhiều lần hay làm vỡ tĩnh mạch; không nên sử dụng những mẫu máu lấy một cách khó khăn có thể làm kích hoạt các yếu tố đông máu dẫn đến kết quả có thể bị sai lạc.

- Khi lấy máu xong thì phải cho ngay vào ống nghiệm có sẵn chất chống đông. Phải trộn đều chất chống đông( hoặc làm tan khi chất chống đông ở dạng khô) bằng cách lộn ngược ống chậm và đều 3 lần(đối với các chất kháng đông nước) hoặc 12 lần (đối với chất chống đông khô) .Không nên lắc qua mạnh , trong một vài trường hợp có thể gây tan máu , cần phải chú ý tỷ lệ giữa chất chống đông và máu. Nên điều chỉnh thể tích chất chống đông theo trị số của hematocrit, có thể chấp nhận sai số khoảng 5%

- Trước khi xét nghiệm (hoặc nhận mẫu máu từ bệnh phòng ) phải kiểm tra xem mẫu máu có vết bị đông hay không ( tìm các cục máu nhỏ ). Một số không nhỏ các sai sót trong xét nghiệm đông máu là do không chú ý đúng mức vấn đề này . Nếu mẫu máu có triệu chứng nghi ngờ là đã đông , nên từ chối không nhận xét nghiệm và lấy máu lại

- Ngoài ra , trước khi lấy máu cần hỏi xem bệnh nhân có dùng thuốc gì trong những ngày trước đó hay không , chú ý đến các loại thuốc như vitamin K , các chất dẫn xuất từ coumarin, có được truyền máu hay huyết tương không , có điều trị bằng hepatin, a.acetyl salicylic hay các thuốc chống viêm, các loại điều trị này có thể làm sai lệch thời gian Quick hay ngược lại không cho phép phát hiện các rối loạn đông máu hoặc các thuốc co tác dụng lên tiểu cầu(aspirin, thuốc kháng viêm,...)

III. KỸ THUẬT LÀM TAY

A. Kỹ thuật xét nghiệm cầm máu kỳ đầu.

1. Sức bền 'mao mạch :

1.1 Nguyên lý :

- Sức bền mao mạch được biểu thị bằng số nốt xuất huyết xuất hiện ở một vị trí đã chọn trước ( thường là ở nếp khuỷa tay) sau một thời gian giảm áp(dùng bầu giác)hay chịu 1 áp lực đã định trước (dùng dải đo huyết áp)

1.2 Phương pháp thực hiện :phương pháp tăng áp

- Dùng dải đo huyết áp(HA) bao quanh cánh tay bệnh nhân như khi đo HA. Đo HA bệnh nhân .Sau đó duy trì áp suất ở trị số giữa HA tối đa và HA tối thiểu (nhưng không quá 10cmHg ) trong vòng 5phút. Tháo dải đo HA ra và đếm số nốt xuất hiện ở vùng nếp khuỷu tay cho đến 5phút sau khi tháo dải đo huyết áp.Nếu trong khi đang duy trì áp suất mà thấy nốt xuất huyết xuất hiện nhiều,tháo ngay dải đo huyết áp và xét nghiệm có kết quả dương tính.

- Khi xét nghiệm chức năng đông máu toàn bộ,xét nghiệm này thường được thực hiện cùng với xét nghiệm thời gian máu chảy( phương pháp Ivy). Lúc đó nên thực hiện thời gian máu chảy trước, nếu đang duy trì áp suất 4cmHg mà số nốt xuất huyết xuất hiện, có thể kết luận xét nghiệm sức bền mao mạch dương tính. Nếu thực hiện xong thời gian máu chảy với kết quả dưới 6 phút mà không thấy xuất hiện nốt xuất huyết nào, tăng áp suất đến trị số HA trung bình của bệnh nhân trong 5 phút nữa rồi xem kết quả.

1.3 Trị số bình thường:

- Bình thường, số nốt xuất huyết xuất hiện phải dưới 7 nốt. Khi số nốt xuất huyết nhiều hơn 7, kết quả được ghi là dương tính, từ ( + ) đến (++++) tùy theo số nốt xuất huyết.

1.4 Nguyên nhân sai lầm:

- Các nốt xuất huyết đã có sẵn trước khi xét nghiệm. Do đó trước khi xét nghiệm phải quan sát kỹ vùng da định đếm.

- Thực hiện xét nghiệm 2 lần tại cùng 1 vị trí

- Kết quả có thể sai lạc nếu đưa áp suất lên cao.

2. Thời gian máu chảy( Ts ): Phương pháp Ivy

2.1 Nguyên lý:

Đo thời gian máu chảy của các vết thương tạo nên ở mặt duỗi cánh tay, dưới một áp suất đã định, được duy trì không đổi trong thời gian xét nghiệm.

2.2 Dụng cụ:

- Máy đo HA, đồng hồ bấm giây.

- Kim chủng, giấy thấm.

- Bông gạc, ete.

2.3 Phương pháp thực hiện:

- Bọc dải đo HA quanh cánh tay bệnh nhân. Bơm tạo áp suất 4cmHg và giữ không đổi. Chọn 1 vùng ở mặt duỗi của cẳng tay, không có mạch máu thấy được và không có lông. Sát trùng bằng ete. Đợi 1-2 phút cho ete bay hết, dùng kim chủng đâm mạnh thẳng góc với da cho đến chỗ cản của kim, tạo nên 2-3 vết thương nằm ngang cách nhau ít nhất 2cm sâu đến lớp hạ bì. Khởi động đồng hồ bấm giây. Dùng thấy thấm thấm 30 giây 1 lần. Ghi thời gian máu chảy của từng vết thương. Tháo dải đo HA ra. Kết quả xét nghiệm là trị số trung bình các thời gian máu chảy của các vết thương.

2.4 Trị số bình thường:

- Thay đổi từ 1-4 phút. Phưong pháp này nhạy và có lợi là khi thực hiện dưới một áp suất không đổi có thể tránh được những sai lầm do rối lọan vận mạch. Những kết quả trên 4 phút đều được xem là khác thường.

2.5 Nguyên nhân sai lầm:

- Thời gian máu chảy có thể bị sai lệch do bệnh nhân dùng thuốc(aspirin, corticoid,...).

- Dùng kim đâm quá sâu hay quá nông đều làm ảnh hưởng đến kết quả. Ở trẻ em nên sử dụng kim chủng cạn hơn.

- Trong 1 vài trường hợp, một trong các vết thương chảy máu nhiều và kéo dài, có thể do đâm trúng mạch máu nằm khá sâu. Lúc đó, nếu thời gian máu chảy của các vết kia không phù hợp với nhau, phải thực hiện lại xét nghiệm.

3. Đếm tiểu cầu, quan sát hình thái, độ tập trung:

3.1 Đếm tiểu cầu:

Có nhiều phương pháp đếm với các loại dung dịch đếm và cách tính kết quả khác nhau, hoặc đếm bằng máy điện tử. Phương pháp đếm máy có ưu điểm là chính xác hơn, đặc biệtlà trường hợp có số tiểu cầu giảm rất thấp. Tuy nhiên, cần lưu ý: số lượng tiểu cầu là chỉ số rất dễ bị ảnh hưởng do điện, do dung dịch đếm, do trục trặc của bộ phận rửa,...

• Trị số bình thường : 150-350*109/l

3.2 Quan sát hình thái và độ tập trung tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm Giêmsa:

- Bình thường, tiểu cầu bắt màu tím nhạt, không có nhân, kích thước 1-4μm, tế bào chất trong suốt có các hạt đỏ. Nếu máu chưa qua chống đông thì tiểu cầu thường đứng thành cụm(≥3 tiểu cầu).

- Trong bệnh lý có thể gặp:

+ Tiểu cầu có kích thước to hơn bình thường, có thể gấp 2-3 lần tiểu cầu bình thường; đôi khi to bằng hoặc hơn lymphocyte( gọi là tiểu cầu khổng lồ). Một số có nhân giả loạn dưỡng, đôi khi có chân giả, ít ngưng tập. Hiếm thấy tiểu cầu có kích thước nhỏ, thường kèm theo giảm vật chứa trong tiểu cầu( bệnh kho dự trữ ).

+ Nhiều bệnh lý làm ảnh hưởng đến độ tập trung tiểu cầu:

• Độ tập trung tiểu cầu tăng trong 1 số bệnh thuộc hội chứng tăng sinh tủy.

• Độ tập trung tiểu cầu giảm trong 1 số bệnh lý máu : suy tủy xương, leukemia, bệnh Glanzmann, Dengue xuất huyết,...

4. Co cục máu : kỹ thuật của Budtz- Olzen:

4.1. Nguyên lý:

Xác định định tính hay định lượng mức độ co của cục đông fibrin sau khi máu đã đông trong ống nghiệm thủy tinh.

4.2. Dụng cụ:

- Ống nghiệm thủy tinh đã tráng bằng nước muối sinh lý 9‰.

- Nồi chưng cách thủy 370C

4.3 Phương pháp thực hiện:

Lấy 3ml máu tĩnh mạch( không chống đông ) cho vào 2 ống nghiệm thủy tinh chưng cách thủy 370C cho đến khi máu đông( thời gian máu đông Lee-White ). Sau đó vẫn để yên các ống nghiệm trong nồi chưng cách thủy 4 giờ nữa và xác định mức độ co cục máu định tính từ 0 đến (+++) hay định lượng bằng cách đo lượng huyết thanh rỉ ra.

4.4 Kết quả:

- Mức độ co cục máu được biểu thị từ 0(không co) đến ( +++ ) ( co hoàn toàn)

- Bình thường cục máu phải co hoàn toàn. Trong 1 số trường hợp bệnh lý, cục máu không co hoặc co không hoàn toàn; ngoài ra có thể gặp 1 số hiện tượng khác : cục máu co nhưng dưới đáy có rất nhiều hồng cầu hoặc cục máu co nhưng nhanh chóng bị tan ra.

- Sự co cục máu phụ thuộc vào số lượng và chất lượng tiểu cầu, lượng fibrinogen và thể tích khối hồng cầu(Hct). Tăng fibrinogen máu và đa hồng cầu rất khó làm co cục máu.

B. Xét nghiệm đông máu:

1. Thời gian máu đông: Phương pháp Lee-White:

1.1 Nguyên lý:

Thời gian máu đông là khoảng thời gian từ khi máu tiếp xúc với một bề mặt lạ cho đến khi thành cục, phản ánh hiệu lực của cơ chế đông máu.

Thời gian máu đông rất nhạy với tất cả các điều kiện bên ngoài như: nhiệt độ, bề mặt tiếp xúc, lẫn lộn dịch tổ chức, nổi bọt,... Phương pháp Lee-White nhằm loại bỏ ảnh hưởng của mọi yếu tố ngoại lai có thể gây sai lầm trong kết quả bằng cách ấn định các tiêu chuẩn nghiêm ngặt.

1.2 Dụng cụ:

- Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch.

- 2 ống nghiệm thủy tinh khô, sạch.

- Nồi chưng cách thủy 370C.

- Đồng hồ bấm giây.

1.3 Phương pháp thực hiện:

- Chưng sẵn 2 ống nghiệm trong nồi chưng cách thủy.

- Lấy 2ml máu tĩnh mạch đúng cách. Khởi động đồng hồ bấm giây ngay khi máu lọt vào bơm tiêm.

- Lấy kim khỏi bơm tiêm, cho vào mỗi ống nghiệm 1ml máu. Để máu chảy dọc thành ống, tránh làm nổi bọt hoặc dao động máu nhiều.

- Nút kín 2 ống nghiệm bằng bông không thấm nước, để ngay vào nồi chưng cách thủy.

- Sau 3 phút, lấy ống nghiệm thứ nhất ra và nghiêng ống 450, cứ 30 giây một lần cho đến khi có thể nghiêng ống 900 mà máu không chảy loang ra, nghĩa là máu đã đông.

- Quan sát ngay ống nghiệm thứ hai theo cách trên cho đến khi máu trong ống đông. Bấm đồng hồ ngay sau khi máu trong ống thứ hai đông.

- Thời gian máu đông của bệnh nhân chính là thời gian đông của ống nghiệm thứ hai.

1.4 Kết quả:

- Bình thường: 5-12 phút

- Phải dùng 2 ống nghiệm vì:

• Ống thứ nhất bị dao động nhiều nên máu nhanh đông hơn.

• Ống thứ hai được để yên trong thời gian quan sát ống thứ nhất nên chính xác hơn.

1.5 Nguyên nhân sai lầm:

Cần tuân thủ một số điều kiện chuẩn sau:

- Các ống nghiệm phải tuyệt đối sạch, có đường kính hoàn toàn giống nhau.

- Phải lấy máu đúng cách.

- Không làm nổi bọt khí khi cho máu từ bơm tiêm vào ống nghiệm.

- Phải tôn trọng nhiệt độ chuẩn. Dưới 200C, các kết quả đều không có ý nghĩa.

- Phải khởi động đồng hồ bấm giây ngay khi máu lọt vào bơm tiêm.

- Chú ý đến số lượng hồng cầu vì số lượng hồng cầu có thể ảnh hưởng đến thời gian đông máu: thời gian ngắn lại khi Hct giảm và kéo dài khi Hct tăng.

Giới hạn bình thường của thời gian máu đông Lee-White thay đổi theo từng phòng xét nghiệm và có khi ngay ở 1 phòng xét nghiệm cũng thay đổi theo từng thời điểm. Do đó, tốt nhất là hằng tuần nên thực hiện xét nghiệm với ít nhất 1 nguời bình thường.

2. Thời gian Howell: thời gian phục hồi Calci.

1.1. Nguyên lý:

Thời gian phục hồi calci của huyết tương giàu tiểu cầu có cùng ý nghĩa với thời gian máu đông, phản ánh hoạt tính đông máu nội sinh của huyết tương. Khi máu được chống đông bằng citrate sodium, sau đó thêm ion caici vào( ion calci có ái tính cao hơn ), cơ chế đông máu sẽ được khởi động vào bất kỳ lúc nào ta muốn.

2.2 Dụng cụ và thuốc thử:

- Tách lấy huyết tương giàu tiểu cầu từ máu chống đông bằng citrate 3,8% trong ống nghiệm plastic.

- CaCl2 0,025M.

- Nồi chưng cách thủy 370C

- Ống nghiệm khô, sạch.

- Pipet, đồng hồ bấm giây.

2.3 Phương pháp thực hiện:

- Trong 1 ống nghiệm chưng cách thủy 370C, cho vào 0,2ml huyết tương.

- Đợi 2 phút để cân bằng nhiệt trong ống nghiệm, thêm 0,2ml CaCl2 0,025M đồng thời khởi động đồng hồ bấm giây. Lắc trộn đều.

- Xác định thời gian đông bằng cách nghiêng nhẹ ống vào những thời điểm cách đều nhau cho đến khi đông. Ghi thời gian đông

- Luôn luôn phải thực hiện cùng 1 lúc với 1 mẫu chứng bình thường.

2.4 Kết quả:

- Bình thưòng: 1,5 - 2,5 phút.

Sự kéo dài thời gian phục hồi calci chỉ có ý nghĩa khi vượt quá 60 giây so với bình thường.

- Kết quả này rất nhạy với các điều kiện xét nghiệm, do đó phải xử lý với mẫu chứng cùng 1 lúc và trong cùng những điều kiện với mẫu nghiệm.

- Một thời gian phục hồi calci bị rút ngắn không phản ánh 1 tình trạng tăng đông.

2.5 Nguyên nhân sai lầm:

Cần tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện chuẩn sau:

- Phải lấy máu đúng cách.

- Xét nghiệm trong vòng 3 giờ sau khi lấy máu vì các yếu tố dễ hỏng như yếu tố V, VIII có thể tự hoạt hóa.

- Các ống nghiệm có đường kính giống nhau và tuyệt đối sạch.

- Các điều kiện tách huyết tương phải hoàn toàn giống nhau đối với mẫu nghiệm và mẫu chứng( tốc độ, thời gian ly tâm,...). Tiểu cầu càng ít thì thời gian đông càng dài.

- Tôn trọng nồng độ CaCl2 yêu cầu. Thừa hay thiếu calci đều kéo dài thời gian phục hồi calci.

2. Thời gian Prothrombin- thời gian Quick( PT ):

3.1 Nguyên lý:

Khi huyết tương đông trước sự hiện diện của thromboplastin tổ chức toàn phần hoạt động và một nồng độ calci tối ưu, thời gian đông sẽ chỉ phụ thuộc vào nồng độ yếu tố II( prothrombin) và các yếu tố biến đổi prothrombin: V, VII, X, với điều kiện là lượng fibrinogen huyết bình thường và không có chất kháng đông.

3.2 Dụng cụ và thuốc thử:

- Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch.

- Ống nghiệm. pipet.

- Nồi chưng cách thủy 370C.

- Đồng hồ bấm giây.

- Dung dịch citrate 3,8%

- Thuốc thử PT( thromboplastin-Ca ): Neoplastin CI5

3.3. Phương pháp thực hiện:

- Đánh dấu ống nghiệm : ống chứng và ống test.

- Lần lượt cho 0,1ml huyết tương bình thường vào ống chứng và 0,1ml huyết tương bệnh nhân vào ống test, ủ trong nồi chưng cách thủy 370C khoảng 1-2 phút.

- Cho rất nhanh 0,2ml Neoplastin CI5 đã ủ trước ở 370C. Bấm đồng hồ cùng lúc. Lắc đều.

- Nhẹ nhàng nghiêng nhanh ống nghiệm nhiều lần để quan sát các dấu hiệu đông đầu tiên.

- Bấm đồng hồ khi xuất hiện màng đông trong ống nghiệm

- Tiến hành đo như trên 2 lần, kết quả 2 lần đo của 1 mẫu không được chênh lệch quá 1 giây.

3.4 Kết quả:

- Tùy theo lô thuốc thử sử dụng, thời gian prothrombin của huyết tương chứng từ 12 - 15 giây.

- Kết quả có thể biểu thị theo các đơn vị giây, % tiêu thu prothrombin hoặc INR.

• Việc tính tỷ lệ % dựa vào biểu đồ do nhà sản xuất cung cấp hoặc biểu đồ được lập từ nhiều độ pha loãng khác nhau của huyết tương người bình thường( dung dịch pha loãng : Michaelis Citrat ).

Một thời gian prothrombin được gọi là kéo dài khi dài hơn thời gian chứng ít nhất 2 giây hoặc % tiêu thụ prothrombin giảm dưới 70% với điều kiện là lượng fibrinogen không giảm và huyết tương không chứa heparin.

• Hệ thống ISI/INR:

Chỉ sử dụng cho các bệnh nhân đang điều trị với thuốc kháng đông dạng uống và đang trong giai đoạn ổn định; không sử dụng cho các trường hợp sau: bệnh nhân bắt đầu điều trị thuốc kháng đông, bệnh nhân vừa mới thay đổi liều lượng thuốc, người bình thường và các bệnh cảnh lâm sàng khác.

INR= ( PT bệnh nhân / PT chứng ) ISI

Các kit thromboplastin bán sẵn trên thị trường đều cho sẵn chỉ số ISI và bảng tra để tính INR.

3.5 Nguyên nhân sai lầm:

- Thuốc thử và mẫu chứng không đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng.

- Mẫu máu lấy không chuẩn.

- Mẫu máu phải được tiến hành xét nghiệm trong vòng 4 giờ sau khi lấy để tránh tình trạng thoái hóa của yếu tố V, gây kéo dài giả tạo.

- Tăng hay giảm số lượng hồng cầu có thể ảnh hưởng đến kết quả PT, khi đó cần hiệu chỉnh lượng chống đông theo Hct:

VCĐ = 0,00185(100 - Hct)*Vmáu.

3. Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa-APPT:

3.1. Nguyên lý:

Phục hồi calci cho huyết tương trước sự hiện diện của chất thế yếu tố 3 tiểu cầu(cephalin) sau khi đã hoạt hóa huyết tương này bằng kaolin, thời gian đông của huyết tương sẽ phụ thuộc vào các yếu tố của con đường nội sinh : XII, XI, IX, VIII, X, V, II, và I.

3.2. Dụng cụ và thuốc thử:

- Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch.

- Ống nghiệm, pipet, đồng hồ bấm giây.

- Nồi chưng cách thủy 370C.

- Dung dịch citrate 3,8%

- CaCl2 0,025M

- Thuốc thử APTT, ví dụ CK Prest của Stago. APTT là xét nghiệm phụ thuộc thuốc thử, trên thị trường có nhiều loại thuốc thử để thực hiện APTT. Chọn lựa thuốc thử tùy thuộc vào hoàn cảnh lâm sàng của bệnh nhân.

• Trong bối cảnh bilan tiền phẫu hay thăm dò hội chứng xuất huyết, phải ưu tiên đánh giá nguy cơ xuất huyết nên phải dùng thuốc thử nhạy cảm với sự thiếu hụt các yếu tố.

• Trong bilan huyết khối, sảy thai tự ý hoặc bệnh tự miễn, chủ yếu phải nghiên cứu kháng đông lưu hành( ACC ) nên phải sử dụng thuốc thử có xu hướng nhạy cảm với ACC.

Trong thử nghiệm APTT, các yếu tố đụng chạm cần phải được hoạt hóa trước nên APTT là loại thử nghiệm 2 thì:

• Thì 1 : ủ huyết tương ở 370C như hầu hết các thử nghiệm đông máu khác, nhằm tạo nhiệt độ tối ưu tương tự trong cơ thể cho hoạt động của các yếu tố.

• Thì 2 : ủ huyết tương với thuốc thử để hoạt hóa các yếu tố đụng chạm.

Sau cùng mẫu thử được phục hồi calci sẽ khởi phát đường đông máu nội sinh.

3.3. Phương pháp thực hiện:

- Đánh dấu ống nghiệm : ống chứng và ống test.

- Lần lượt cho 0,1ml huyết tương bình thường vào ống chứng và 0,1ml huyết tương bệnh nhân vào ống test.

- Tiếp tục cho 0,1ml dung dịch CK Prest lần lượt vào ống chứng và ống test. Lắc trộn đều.

- Ủ ở 370C trong 3 phút trong nồi chưng cách thủy.

- Cho rất nhanh 0,1ml CaCl2 0,025M đã ủ trước ở 370C vào ống nghiệm, bấm đồng hồ cùng lúc. Lắc trộn đều.

- Thỉnh thoảng nghiêng ống để quan sát, bấm đồng hồ khi màng đông xuất hiện.

- Tiến hành đo như trên, kết quả 2 lần đo của 1 mẫu không được chênh lệch quá 2 giây.

3.4. Kết quả:

- Tùy theo thuốc thử, APTT bình thường từ 30-50 giây.

APTT được cho là bệnh lý khi APTT bệnh / APTTchứng > 1,2.

3.5. Nguyên nhân sai lầm:

- Vì dựa trên thời gian phục hồi calci( thời gian Howell ) nên mọi nguyên nhân làm sai lạc kết quả xét nghiệm này đều có thể làm APTT sai lạc.

- Huyết tương phải xét nghiệm trong vòng 2 giờ sau khi lấy mẫu.

- Phải ủ huyết tương và thuốc thử ít nhất trong 2 phút để chắc chắn hoạt hóa các yếu tố đụng chạm.

4. Thời gian Thrombin:

4.1. Nguyên lý:

Thời gian đông của huyết tương chống đông bằng citrate trong sự có mặt của thrombin. Nó thăm dò 2 bước đầu tiên của sự hình thành fibrin: hoạt động tiêu protein của thrombin và polymer hóa, nhưng không phụ thuộc yếu tố XIII. Thời gian thrombin nhạy cảm với heparin và những chất ức chế thrombin.

4.2. Phương pháp thực hiện:

- Thuốc thử: pha loãng dung dịch thrombin mẹ thành 1/10 với huyết thanh sinh lý, cho phép nhận được thời gian thrombin chứng khoảng 20 giây, và bảo quản ở ngăn đông đá( dung dịch thrombin mẹ được tái chế từ thrombin đông khô).

- Kỹ thuật:

• 0,2ml huyết tương cho vào tube thủy tinh và đặt vào bể ấm 370C.

• Để 10-20 giây.

• Thêm nhanh 0,2ml dung dịch thrombin đã pha loãng.

• Ghi nhận thời gian đông.

4.3. Kết quả:

- Bình thường: 15-19 giây.

Kéo dài khi lớn hơn chứng 3-5 giây.

4.4. Nguyên nhân sai lầm:

- Giống như ở thời gian PT và APTT.

- Ngoài ra, dung dịch thrombin pha loãng không bền vững và thrombin có thể hấp phụ trên thành ống thủy tinh, vì vậy chúng nên được điều chế sử dụng ngắn ngày và bắt buộc bảo quản ngăn đá.

5. Định lượng fibrinogen:

5.1. Nguyên lý:

Tốc độ biến đổi fibrinogen thành fibrin phụ thuộc vào chức năng và nồng độ fibrinogen và vào lượng thrombin thêm vào hệ thống xét nghiệm. Với sự có mặt một lượng thừa thrombin, thời gian đông của mẫu huyết tương pha loãng sẽ tương quan trực tiếp với nồng độ fibrinogen.

5.2. Dụng cụ và thuốc thử:

- Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch

- Ống nghiệm, pipet, đồng hồ bấm giây.

- Nồi chưng cách thủy 370C.

- Móc bằng dây platin có cán dài.

- Dung dịch citrate 3,8%

- Dung dịch đệm Owren-Koller, pH=7,35

- Thuốc thử sử dụng là thrombin, ví dụ Fibri-Prest của Stago đã định chuẩn hàm lượng calcium thrombin và bổ sung chất ức chế heparin để sử dụng được cho các mẫu máu bệnh nhân có heparin, kèm theo biểu đồ chuẩn để tính kết quả nồng độ fibrinogen.

6.3 Phương pháp thực hiện:

Máu tĩnh mạch chống đông với sodium citrate 3,8% tỷ lệ 1/10, ly tâm, tách huyết tương.

- Pha loãng huyết tương 1/10: 50μl huyết tương + 450μl dung dịch đệm Owren-Koller. Mẫu huyết tương sau khi pha loãng cần được tiến hành đo trong vòng 15 phút để tránh tình trạng thoái hóa fibrinogen trong môi trường đệm.

- Cho vào ống nghiệm 0,2ml huyết tương đã pha loãng, cho vào nồi chưng cách thủy, chờ 1-2 phút.

- Cho rất nhanh 0,2ml Fibri-Prest( thrombin ) đã ủ trước ở 370C vào ống nghiệm. Bấm đồng hồ cùng lúc.

- Xác định chính xác thời điểm xuất hiện những sợi fibrin đầu tiên bằng cách nhúng xuống nhấc lên 1 cách nhẹ nhàng liên tục cái móc bằng dây platin. Khi nhấc móc lên thấy có sợi fibrin đầu tiên thì bấm đồng hồ, ghi thời gian đông.

- Tiến hành đo 2 lần, kết quả 2 lần đo của 1 mẫu không được chênh lệch quá 1 giây.

- Khi thời gian đông quá ngắn hay quá dài phải làm lại xét nghiệm và huyết tương được pha loãng nhiều hơn hay ít hơn tùy trường hợp.

6.4. Kết quả:

Tính nồng độ fibrinogen dựa vào biểu đồ mẫu tự làm với huyết tương bình thường hoặc dựa vào biểu đồ chuẩn được cung cấp kèm theo lô thuốc thử.

Bình thường: 200-400mg/dl

7. Nghiệm pháp Von-Kaulla:

7.1. Nguyên lý:

Huyết tương được pha loãng rồi toan hóa nhằm tách euglobulin( là thành phần có chứa các chất hoạt hóa plasminogen mà chủ yếu là t-PA, plasminogen và fibrinogen ) đồng thời loại bỏ tất cả thành phần ức chế quá trình tiêu cục đông. Rồi sau đó cho euglobulin đông trở lại( như làm Howell) nhờ đó mà có thể theo dõi sự tiêu của euglobulin được dễ dàng hơn.

7.2. Dụng cụ và thuốc thử:

- Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch.

- Ống nghiệm, pipet, đồng hồ bấm giây.

- Nồi chưng cách thủy 370C.

- Giấy thấm, đũa thủy tinh.

- Dung dịch citrate 3,8% , nước cất, CaCl2 M/10.

- Dung dịch đệm Michaelis pH=7,35

- Acid acetic 2%

7.3. Phương pháp thực hiện:

- Đánh dấu ống nghiệm : ống chứng và ống test.

- Lần lượt cho 0,3ml huyết tương bình thường vào ống chứng và 0,3ml huyết tương bệnh nhân vào ống test.

- Cho vào mỗi ống 3ml nước cất.

- Thêm vào mỗi ống 1 giọt acid acetic 2 %, dùng đũa thủy tinh khuấy đều.

- Đem ly tâm tốc độ 4500-5000vòng/phút trong 5phút.

- Lấy ống nghiệm ra, loại bỏ nước trong ở trên và lấy kết tủa ở dưới, dùng giấy thấm thấm khô thành ống nghiệm.

- Cho vào mỗi ống nghiệm 0,3ml dung dịch đệm Michaelis(đã pha loãng ¼) và dùng đũa thủy tinh đánh cho tan tủa.

- Cho vào mỗi ống nghiệm 1 giọt CaCl2 M/10 để ở 370C cho đến khi đông.

- Ghi thời điểm đông và theo dõi thời gian tan hoàn toàn bằng cách 15 phút nhấc ống lên xem 1 lần.

- Xét nghiệm kết thúc khi cục đông tan hoàn toàn.

7.4. Kết quả:

Ở người bình thường, thời gian tiêu euglobulin, từ khi đông đến khi tan phải từ 3giờ trở lên.

- Thời gian tiêu euglobulin kéo dài không có ý nghĩa bệnh lý( ngoại trừ trường hợp không có plasminogen, lúc này thời gian tiêu euglobulin sẽ kéo dài vô tận, nghĩa là cục đông sẽ không tan).

- Biểu hiện tiêu fibrin khi thời gian tiêu euglobulin xảy ra trong vòng 1giờ đầu, tùy mức độ:

* 0-15 phút : tiêu sợi huyết cấp.

* 15-30 phút : tiêu sợi huyết trung bình

* 30-45 phút : tiêu sợi huyết nhẹ

45-60 phút : tiêu sợi huyết thoáng qua.

☺ Lưu ý : Có thể có hiện tượng cục đông euglobulin không hình thành được( không đông ). Lý do của hiện tượng này có thể do hệ thống hoạt hóa plasminogen quá mạnh cho nên đông đến đâu tan đến đó, nên không còn thấy rõ cục đông nữa; hoặc có thể do đã bị tiêu thụ hết các yếu tố của hệ thống đông máu( DIC ) nên không thể đông được.

- Cách phân biệt: Thêm 1 giọt huyết thanh bình thường vào dung dịch cuglobulin rồi cho ion calci vào, kết quả:

• Nếu do tiêu fibrin quá mạnh: có đông được nhưng sau đó tan ngay.

• Nếu do hết các yếu tố đông máu (DIC):có đông được nhưng cục đông sau 60 phút vẫn không tan.

8. Nghiệm pháp Ethanol:

8.1. Nguyên lý:

Các monomer của fibrin là những sản phẩm trung gian giữa fibrin, nó là kết quả tác động phân hủy của thrombin. Khi lượng thrombin thấp thì các monomer không đủ để trùng hợp tạo nên cục fibrin. Các fibrin monomer, fibrinogen và các sản phẩm thoái giáng tạo thành phức hợp hòa tan, những phức hợp này sẽ được phát hiện do bị gel hóa dưới tác dụng của rượu ethanol.

8.2. Dụng cụ và thuốc thử:

- Máu chống đông citrate lấy đúng cách, ly tâm 4500vòng/phút trong 10phút ớ nhiệt độ phòng( hoặc ở 40C ),tách lấy huyết tương.

- Ethanol 960, nước cất.

- Ống nghiệm, pipet.

8.3 Phương pháp thực hiện:

- Thực hiện xét nghiệm ngay sau khi lấy máu, trong vòng 1 giờ.

- Cho 0,5ml huyết tương vào ống nghiệm.

- Thêm 0,15ml Ethanol(đã pha loãng ½ bằng nước cất ngay trước khi xét nghiệm ).

- Lắc đều và để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó nghiêng nhẹ ống đến khi nằm ngang xem có chất keo( gel ) xuất hiện không.

8.4. Kết quả:

Chất keo xuất hiện( kết quả (+) ) chứng tỏ có các phức hợp hòa tan trong mẫu nghiệm, bằng chứng của 1 tình trạng DIC. Tuy nhiên kết quả âm tính không loại trừ được chẩn đoán này.

8.5. Nguyên nhân sai lầm:

- Lấy mẫu không đúng cách.

- Tăng fibrin huyết quá nhiều khiến phản ứng (+) giả.

- Loạn fibrin huyết.

9. Bán định lượng D-Dimer hoặc FDPs bởi ngưng kết hạt latex:

9.1. Nguyên lý:

Đây là phương pháp bán định lượng D-Dimer hoặc FDPs( sản phẩm thoái giáng fibrinogen và fibrin ) bởi ngưng kết hạt latex đã mẫn cảm kháng thể đơn dòng, sự ngưng kết có thể thấy bằng mắt thường khi nồng độ D-Dimer≥ 0,5µg/ml hoặc FDPs≥ 2,5µg/ml.

9.2. Thuốc thử:

- Huyền dịch latex mẫn cảm kháng thể đơn dòng chuột chống D-Dimer(hoặc FDPs ) người.

- Đệm glycerin để pha loãng huyết tương.

- Huyết tương người loại bỏ D-Dimer hoặc FDPs( chứng âm ).

- Huyết tương người chứa D-Dimer hoặc FDP (chứng dương ).

- Tấm bảng nền đen, que khuấy.

9.3. Phương pháp thực hiện:

Thực hiện xét nghiệm bằng cách cho:

- 20µl huyết tương thử nghiệm trên tấm bảng nền đen ở vị trí số 1.

- Tương tự 20µl huyết tương chứng âm và chứng dương ở vị trí số 2 và 3.

- Thêm 20µl huyền dịch latex vào mỗi loại huyết tương trên.

- Khuấy đều bằng que khuấy.

- Quay tròn trong vòng 3 phút và quan sát sự nhưng kết.

9.4. Kết quả:

- Bình thưòng: Lượng D-DimerHT < 0,5 µg/ml

Lượng FDP < 2,5 µg/ml

- Ở vị trí 1 ta thấy ngưng kết, như vậy lượng D-Dimer ≥ 0,5 µg/ml hoặc FDP ≥ 2,5 µg/ml.

- Khi xét nghiệm dương tính thì thực hiện phương pháp bán định lượng bằng cách pha loãng huyết tương thử nghiệm ½, ¼ , ⅛, ... trong đệm glycine và dừng lại ở độ pha loãng không còn hiện tượng ngưng kết.

HUYẾT TƯƠNG Lượng D-Dimer hoặc FDPs

Không pha loãng Pha loãng 1/2 Pha loãng 1/4 Pha loãng 1/8 Pha loãng 1/8

(+) (-) 0,5≤D-Dimer<1 hoặc 2,5≤FDPs<5

(+) (+) (-) 1≤D-Dimer<2 hoặc 5≤FDPs<10

(+) (+) (+) (-) 2≤D-Dimer<4 hoặc 10≤FDPs<20

(+) (+) (+) (+) (-) 4≤D-Dimer<8 hoặc 20≤FDPs<40

(+) (+) (+) (+) (+) D-Dimer≥8 hoặc FDPs ≥40

9.5. Hạn chế của thử nghiệm:

- Hiện diện lượng cao yếu tố thấp có thể gây ngưng kết.

- Lấy máu khó khăn gây hoạt hóa đông máu.

IV. KỸ THUẬT TRÊN MÁY BÁN TỰ ĐỘNG ST art4:

- Tên máy : Máy đông máu bán tự động.

- Model : ST art4

- Nước sản xuất : Pháp

- Điện thế : 220V

1. Neoplastin CI:

1.1. Nguyên lý của thử nghiệm:

- Nguyên lý của thử nghiệm là sử dụng calci thromboplastin để đo thời gian đông của huyết tương bệnh nhân và so sánh với một kết quả chuẩn bình thường.

- Thử nghiệm xác định hoạt động của các yếu tố đông máu ngoại sinh: II, V, VII, X.

1.2. Lấy mẫu:

- Lấy máu vào dung dịch chống đông citrate trisodium 0,109M theo tỷ lệ 1 Citrat/ 9 máu

- Ly tâm : 2500vòng trong 10 phút.

- Bảo quản huyết tương : 8giờ ở nhiệt độ 20±50C

Không bảo quản huyết tương ở 2-80C.

1.3. Kit:

- Néoplastin CI 5 (Cat. No. 00323):

• 6 Lọ thuốc thử 1: 5 ml ( Néoplastin CI 5)

• 6 Lọ thuốc thử 2: 5 ml (dung môi)

Tương đương 300 xét nghiệm.

- Néoplastin CI 10 (Cat.No. 00329):

• 12 Lọ thuốc thử 1: 10 ml ( Néoplastin CI 10 )

• 12 Lọ thuốc thử 2: 10 ml (dung môi)

Tương đương 1200 xét nghiệm.

1.4. Thuốc thử và các vật liệu khác:

- STA - Owren-Koller(Cat. No. 00360)

- Etaloquick (Cat. No. 00496) hoặc Unicalibrator (Cat. No. 00625)

- Coag control N+P (Cat. No. 00621) hoặc System Control N+P (Cat. No. 00617): có 1 lô chứng bình thường và 1 lô chứng bất thường.

- Các dụng cụ thong thường của phòng xét nghiệm: máy ly tâm, nước cất,...

1.5. Bảo quản và chuẩn bị thuốc thử:

Thuốc thử Chuẩn bị Ổn định sau khi pha/ mở thuốc thử Vị trí bảo quản trên máy ST art4

Lọ thuốc thử 1

( Néoplastin CI 5 hoặc 10) Đổ dung dịch ở lọ 2 vào lọ 1 của cùng lô thuốc thử. Lọ thuốc sau khi pha phải được bảo quản ở 370C ít nhất 30phút trước khi sử dụng. • 8 giờ ở 370C

• 24giờ ở 20±50C

• 8ngày ở 2-80C. 370C với thanh khuấy từ.

Lọ thuốc thử 2

( Dung môi ) Lọ 5ml hoặc 10ml sẵn sàng để sử dụng

Etaloquick

( Thuốc thử 1, 2 và 3 ) Cho thêm 0,5ml nước cất.Lắc đều. Có thể để thuốc thử ở nhiệt độ phòng(18-250C) trong 30phút. 4 giờ ở 20±50C

Unicalibrator Cho thêm 1ml nước cất. Lắc đều. Có thể để thuốc thử ở nhiệt độ phòng(18-250C) trong 30phút. 4 giờ ở 20±50C

Coag Control N

Coag Control P

(Dùng cho làm tay) Cho thêm 1ml nước cất. Lắc đều. Có thể để thuốc thử ở nhiệt độ phòng(18-250C) trong 30phút. 4 giờ ở 20±50C

System Control N

System Control P

(Dùng cho máy và tay) Cho thêm 1ml nước cất. Lắc đều. Có thể để thuốc thử ở nhiệt độ phòng(18-250C) trong 30phút. 4 giờ ở 20±50C

1.6. Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Thử nghiệm chuẩn có thể được thực hiện bằng 1 trong các cách sau:

- Etaloquick: sử dụng các mức khác nhau của Etaloquick không pha loãng. Hoặc:

- Unicalibrator: sử dụng dung dịch nguyên chất và các độ pha loãng ½, 1/3, ¼ trong dung dịch STA - Owren-Koller.

Thử nghiệm chuẩn được thực hiện kép. Dữ liệu chuẩn được lưu trong "2: Calibration" lựa chọn từ " Main menu" của máy ST art4.

1.7 . Chuẩn bị mẫu control và mẫu bệnh nhân:

- Huyết tương nguyên.

1.8. Cài đặt các thông số:

* Từ " Main menu" chọn TEST PARAMETERS bằng cách nhấn phím (3) và xác nhận lại bằng phím Enter.

* Chọn PT bằng cách nhấn phím (1) và xác nhận lại bằng phím Enter.

Thời gian tối đa: 70giây

Thời gian ủ: T2: 60giây T1: 0giây

Thực hiện đơn/kép: Kép

Sai số cho phép: 5%

Đơn vị: 1, 2, 6, 7 hoặc 8*

*1 : %, 2: %-INR, 6: giây, 7: tỷ lệ, 8: tỷ lệ-INR

1.9 Tiến hành:

Đặt thanh cuvette vào ủ trước ít nhất 3 phút.

Cho vào mỗi cuvette một viên bi.

Trong cuvette đã ủ 370C:

Ở vị trí ủ:

* Cho vào mỗi cuvette khác nhau:

- Huyết tương( chuẩn, bệnh hoặc chứng): 50µl

* Khởi động đồng hồ ủ để ủ 60giây

* Khi nghe tiếng "tit, tit", chuyển cuvette sang vị trí đo.

* Khởi động Finnpipette thuốc thử

Ở vị trí đo:

* Ấn nút khởi động Finnpipette

* Cho vào mỗi cuvette :

- Thuốc thử đã ủ trước ở 370C (SR-Finntips 1,25ml, nấc số 4): 100µl

▲ Chú ý:

Nhớ bấm bỏ lần thứ nhất Finnpipette vào chai thuốc tương ứng.

1.9. Kết quả:

Kết quả PT có thể được tính bằng nhiều kết quả:

- Giây( thời gian bệnh so với thời gian chứng )

- Tỷ lệ PTbệnh / PTchứng.

- % tiêu thụ

- INR

2.C.K. PREST

2.1. Nguyên lý:

Phục hồi calci cho huyết tương , trước sự hiện diện của một chất thế yếu tố 3 tiểu cầu (cephalin) sau khi đã hoạt hóa huyết tương này bằng kaolin , thời gian đông của huyết tương sẽ phụ thuộc vào các yếu tố của con đường nội sinh :XII, XI , IX, VIII, X, V, II và I

2.2 Lấy mẫu

- Lấy máu vào dung dịch chống đông citrate trisodium 0,109M theo tỷ lệ 1 Citrat/ 9 máu

Sử dụng ống nhựa dẻo hoặc ống thủy tinh tráng Silicon. Khi theo dõi điều trị Heparin, người ta khuyên nên sử dụng ống Diatubes H của Becton Dickinton.

- Ly tâm: 2500g/phút trong 15 phút. Tách huyết tương vào ống nhựa.

- Bảo quản huyết tương: 2giờ ở 20±50C (ống Citrat)

4giờ ở 20±50C (ống Diatube H)

2.3. Kit:

• C.K. Prest 2 (Cat. No. 00598):

- 6 Lọ thuốc thử 1: 2ml ( C.K. Prest 2)

- 6 Lọ thuốc thử 2: 2ml (chất hoạt hóa)

Tương đương 240 xét nghiệm.

• C.K. Prest 5 (Cat. No. 00847)

- 6 Lọ thuốc thử 1: 5ml (C.K. Prest 5)

- 6 Lọ thuốc thử 2: 5ml (chất hoạt hóa)

Tương đương 600 xét nghiệm.

• C.K. Prest 12 (Cat. No. 00916)

- 12 Lọ thuốc thử 1: 12ml (C.K. Prest 12)

- 12 Lọ thuốc thử 2: 12ml (chất hoạt hóa)

Tương đương 2880 xét nghiệm.

2.4. Thuốc thử và các vật liệu khác:

- STA- CaCl2 0,025M (Cat. No. 00367)

- Coag Control N+P (Cat. No. 00621) hoặc System Control N+P (Cat. No. 00617): có 1 lô chứng bình thường và 1 lô chứng bất thường.

- Các dụng cụ thông thường của phòng xét nghiệm: máy ly tâm, nước cất,...

2.5. Bảo quản và chuẩn bị thuốc thử:

Thuốc thử Chuẩn bị Ổn định sau khi pha/ mở thuốc thử Vị trí bảo quản trên máy ST art4

Thuốc thử 1

( C.K. Prest 2, 5 hoặc 12) Đổ dung dịch ở lọ 2 vào lọ 1 của cùng lô thuốc thử. Để thuốc thử ở nhiệt độ phòng (18-250C) trong 30phút. Lắc đều trước mỗi lần sử dụng. • 2ngày ở 20±50C

• 7ngày ở 2-80C

Thuốc thử 2 Chai có sẵn. Lắc đều trước mỗi lần sử dụng.

STA - CaCl2 0.025M Lọ 15ml. Để thuốc thử ở 370C trước khi sử dụng 370C

Coag Control N

Coag Control P

(Dùng cho làm tay) Cho thêm 1ml nước cất. Lắc đều. Có thể để thuốc thử ở nhiệt độ phòng(18-250C) trong 30phút. 4 giờ ở 20±50C

System Control N

System Control P

(Dùng cho máy và tay) Cho thêm 1ml nước cất. Lắc đều. Có thể để thuốc thử ở nhiệt độ phòng(18-250C) trong 30phút. 4 giờ ở 20±50C

2.6. Chuẩn bị mẫu bệnh:

Huyết tương nguyên.

2.7. Cài đặt chương trình:

* Từ màn hình chính, chọn chương trình PARAMETRES bằng cách nhấn nút số 3.

* Tiếp đó chọn xét nghiệm APTT bằng phím 2.

Thời gian tối đa: 120giây.

Thời gian ủ: T2: 180giây T1: 0giây

Đơn / kép: Kép

Sai số cho phép: 5%

Đơn vị(1 đến 8): 6 hoặc 7*

* 6: giây, 7: tỷ lệ

2.8. Tiến hành:

Đặt thanh cuvette vào ủ trước ít nhất 3 phút.

Cho vào mỗi cuvette mỗi viên bi.

Ở vị trí ủ:

* Cho vào mỗi cuvette khác nhau:

- Huyết tương nguyên(bệnh hoặc chứng): 50µl

- Thuốc thử (R1-Finntips 1,25ml nấc số 2): 50µl

* Khởi động đồng hồ ủ để ủ: 180 giây

* Khi nghe tiếng "tit, tit", chuyển cuvette sang vị trí đo.

* Khởi động Finnpipette thuốc thử

Ở vị trí đo:

* Ấn nút khởi động Finnpipette

* Cho vào mỗi cuvette :

STA- CaCl2 đã ủ trước ở 370C(Finntips, nấc số 2): 50µl

▲ Chú ý:

Nhớ bấm bỏ lần thứ nhất Finnpipette vào chai thuốc tương ứng.

2.9. Kết quả:

Tính bằng :

- Giây.

- Tỷ lệ APTTbệnh / APTTchứng.

3.Fibri-Prest:

3.1. Nguyên lý

Trong sự hiện diện của một lượng thừa thrombin, thời gian đông của huyết tương sẽ có mối quan hệ chặt chẽ với lượng fibrinogen của huyết tương.

3.2. Lấy mẫu:

- Lấy máu vào dung dịch chống đông citrate trisodium 0,109M theo tỷ lệ 1 Citrat/ 9 máu

- Ly tâm: 2500g/phút trong 15 phút. Tách huyết tương vào ống nhựa.

- Bảo quản huyết tương: 8giờ ở 20±50C.

3.3. Kit:

-Fibri-Prest Automate( Cat. No. 00613) : 12 lọ 2ml tương đương 480 xét nghiệm.

- Fibri-Prest Automate( Cat. No. 00854) : 12 lọ 5ml tương đương 1200 xét nghiệm.

3.4. Thuốc thử và các vật liệu khác:

- STA - Owren-Koller( Cat. No. 00360)

- Unicalibrator( Cat. No. 00625)

- Coag Control N+P (Cat. No.00621) hoặc System Control N+P (Cat. No. 00617): có 1 lô chứng bình thường và 1 lô chứng bất thường.

- Các dụng cụ thông thường của phòng xét nghiệm: máy ly tâm, nước cất,...

3.5. Pha chế và bảo quản thuốc thử:

Thuốc thử Pha chế Độ ổn định sau khi mở chai hoặc hòa Vị trí đặt ở máy ST art4

Fibri-Prest 2 hoặc 5 Hòa với 2ml (Cat. No. 00613) hoặc 5ml( Cat. No. 00854) nước cất. Để dung dịch tự ổn định trong 30 phút ở nhiệt độ phòng(18-250C). Sau đó lắc đều trước khi sử dụng • 7ngày ở 20±50C

• 14ngày ở 2-80C

Unicalibrator Thêm 1ml nước cất. Để dung dịch tự ổn định trong 30 phút ở nhiệt độ phòng(18-250C). Sau đó lắc đều trước khi sử dụng 4 giờ ở 20±50C

Coag Control N

Coag Control P

(Dùng cho làm tay) Thêm 1ml nước cất. Để dung dịch tự ổn định trong 30 phút ở nhiệt độ phòng(18-250C). Sau đó lắc đều trước khi sử dụng 4 giờ ở 20±50C

System Control N

System Control P

(Dùng cho máy và tay) Thêm 1ml nước cất. Để dung dịch tự ổn định trong 30 phút ở nhiệt độ phòng(18-250C). Sau đó lắc đều trước khi sử dụng 4 giờ ở 20±50C

3.6. Chuẩn bị mẫu chuẩn:

Chọn tỷ lệ pha loãng của Unicalibrator sao cho thời gian đông của mẫu khoảng từ 5 đến 60 giây. Thử nghiệm calib được thực hiện kép. Dữ liệu calib được lưu giữ trong "2: Calibrator" lựa chọn từ "Main Menu".

Ví dụ: Với Unicalibrator có mức fibrinogen 3,20g/l( 320 mg/dl), chuẩn bị các độ pha loãng sau:

Độ pha loãng 1:7 1:10 1:20 1:40

STA - Owren-Koller 0,6ml 1,8ml 1ml 1ml

Unicalibrator 0,1ml 0,2ml

1ml 1ml

Fibrinogen(g/l) 9,14 6,40 3,20 1,60

Fibrinogen(mg/dl) 914 640 320 160

3.7. Chuẩn bị mẫu bệnh và control:

- Pha loãng mẫu bệnh và mẫu control trong dung dịch STA - Owren-Koller theo tỷ lệ 1:20 (0,1ml huyết tương + 1,9ml dung dịch pha loãng)

3.8. Cài đặt chương trình:

* Từ màn hình chính, chọn chương trình PARAMETER bằng cách nhấn phím 3.

* Tiếp đó, chọn xét nghiệm Fib bằng cách nhấn phím 3.

Thời gian tối đa: 70giây.

Thời gian ủ: T2: 60giây T1: 0giây

Đơn / kép: Kép

Sai số cho phép: 5%

Đơn vị(1 đến 8): 3 hoặc 4*

* 3: g/l 4: mg/dl

3.9. Tiến hành:

Đặt thanh cuvette vào ủ trước ít nhất 3 phút.

Cho vào mỗi cuvette mỗi viên bi.

Ở vị trí ủ:

* Cho vào mỗi cuvette khác nhau:

- Huyết tương( chuẩn,bệnh hoặc chứng): 100µl

* Khởi động đồng hồ ủ để ủ: 60giây

* Khi nghe tiếng "tit, tit", chuyển cuvette sang vị trí đo.

* Khởi động Finnpipette thuốc thử

Ở vị trí đo:

* Ấn nút khởi động Finnpipette

* Cho vào mỗi cuvette :

Fibri-Prest Automatic(SR-Finntips 1,25ml,nấc số 2) 50µl

▲ Chú ý:

Nhớ bấm bỏ lần thứ nhất Finnpipette vào chai thuốc tương ứng.

3.10. Kết quả:

Nồng độ fibrinogen được tính bằng g/l hoặc mg/dl.

Nếu thời gian đông của huyết tương pha loãng 1:20:

+ ngắn hơn 5giây, làm lại xét nghiệm với độ pha loãng 1:40 và kết quả được nhân 2.

+ dài hơn 60giây, làm lại xét nghiệm với độ pha loãng 1:10 và kết quả được chia 2.

PHẦN BA: KIỂM TRA TÌNH TRẠNG ĐÔNG MÁU TRƯỚC PHẪU THUẬT.

I. Quy trình kiểm tra:

1. Khám lâm sang và khai thác tiền sử:

Mục đích nhằm sơ bộ đánh giá tình trạng đông máu của bệnh nhân hoặc các bệnh lý, các thuốc ....có ảnh hưởng đến tình trạng đông máu .Những điều cần tìm hiểu là :

-Tiền sử bệnh tật :có bị xuất huyết (chân răng , dưới da , khớp , đường tiêu hóa ...)

-Tiền sử phẫu thuật

-Các bệnh lý cấp và mạn tính khác: sốt xuất huyết, viêm gan, xơ gan, thay van tim .

-Tiền sử dung thuốc : đặc biệt chú ý asparin, kháng viêm không steroid, wafarin,heparin....

-Tiền sử gia đình :có ai bị xuất huyết , huyết khối không ?

2 Xét nghiệm thăm dò nguy cơ xuất huyết

2.1 Thời gian máu chảy

-Kiểm tra cầm máu kỳ đầu

-Nên làm phương pháp Ivy

-Gía trị bình thường để tiến hànhcuộc mổ

2.2 Đếm tiểu cầu và quan sát độ tập trung

-Đánh giá cầm máu và đông máu

-Gía trị bình thường cho cuộc mổ :150-400x10 9/l

2.3 Thời gian prothrombin

-Đánh giá con đường đông máu ngoại sinh

-Gía trị bình thường cho cuộc mổ :

+ Tỷ lệ prothrombin > 70%

+Hoặc INR <1,2 (nếu bệnh nhân dùng thuốc kháng vitamin K )

2.4 Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa APTT (thời gian Cephalin Kaolin )

-Đánh giá con đường đông máu nội sinh

-Gía trị bình thường cho cuộc mổ :

Tỷ lệ APTT bệnh / APTT chứng = 0,8-1,25

2.5 Fibrinogen

-Gía trị bình thường (phương pháp Clauss): 2-4 g/l

Tốt nhất lập trị số bình thường cho mỗi labô đông máu

3. Xét nghiệm thăm dò nguy cơ huyết khối

-Định lượng antỉthombin (AT),protein C,Protein S

-Phát hiện kháng đông lupus và kháng thể kháng phospholipid trong các trường hợp có tiền sử hay hiện tại đang bị huyết khối, hoặc gia đình có người bị huyết khối mà không giải thích được .

II . Phát hiện nguy cơ

1 Nguy cơ xuất huyết

1.1 Thời gian máu chảy kéo dài đơn thuần

Thời gian Ts kéo dài

Khảo sát tiểu cầu Khảo sát thành mạch

số lượng TC số lượng TC số lượng TC

bình thường giảm tăng

Xét nghiệm APTT Hội chứng tăng sinh tủy ác tính

bình thường kéo dài

không có fibrinogen

rối loạn chức năng TC von Willebrand

bẩm sinh mắc phải

CÁC BƯỚC THĂM DÒ Ts KÉO DÀI

-Ts thường kéo dài khi tiểu cầu ≤ 50x109/l và tỉ lệ với mức độ giảm tiểu cầu

-Do dùng thuốc kháng tiểu cầu (Aspirin)

-Nếu TS kéo dài mà không có giảm tiểu cầu , cần tìm :

+Bất thường chức năng tiểu cầu :bẩm sinh hay mắc phải

+Bệnh von willebrand

+Hoặc thiếu fibrinogen(hiếm)

-Bệnh lý tiểu cầu mắc phải thường gặp hơn :Phần lớn do dùng thuốc (kháng tiểu cầu, kháng viêm không steroid, kháng sinh....), hay do bệnh lý kèm theo (suy thận mạn, suy gan ... )

-Bệnh lý tiểu cầu bẩm sinh :Hiếm gặp

Do độ nhạy kém ,1 Ts bình thường không cho phép loại trừ chẩn đoán bệnh von willebrand, hoặc bệnh lý tiểu cầu mức độ bình thường .

1.2 Thời gian prothrombin (PT) kéo dài đơn thuần

TP đánh giá yếu tố VII, X, V, II và fibrinogen .Khi tỷ prothrombin <70% có thể gặp trong các trường hợp :suy tế bào gan, điều trị kháng vitamin K ,bệnh lý gây giảm vitamin K (thiếu hoặc kém hấp thu ), đặc biệt là thiếu yếu tố VII đơn thuần (bẩm sinh hay mắc phải )

Định lượng các yếu tố của phức hệ prothrombin (II,V,VII,X

) và fibrinogen giúp xác định chẩn đoán

1.3 Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa kéo dài đơn thuần

APTT đánh giá các yếu tố tiếp xúc (HMWK, Prekallicren, XII, XI ) và IX,VIII, V, X, II và fibrinogen .Sự kéo dài của APTT có thể biểu hiện :

-Sự hiện diện của Heparin không phân đoạn(UFH) (do điều trị hoặc do mẫu bị nhiễm), có thể xác định được khi có thời gian Thrombin kéo dài và định lượng heparin máu. Các Heparin trọng lượng phân tử thấp(LMWH) gây kéo dài APTT rất ít và thường không hằng định với liều điều trị thông thường. Việc giám sát điều trị Heparin trọng lượng phân tử thấp bằng APTT không thích hợp, chỉ phát hiện khi dùng quá liều.

- Sự thiếu hụt đơn độc hay kết hợp các yếu tố của đường đông máu nội sinh: định lượng các yếu tố này cho phép xác định chẩn đoán. Khi có giảm yếu tố VIII và bệnh cảnh lâm sàng gợi ý, cần định lượng yếu tố willebrand. Định lượng yếu tố VIII, IX,XI giúp phát hiện nguy cơ chảy máu .Sự thiếu hụt yếu tố XII,HMWK và prekallicrin thường không có triệu chứng .

-Sự hiện diện của các chất ức chế mắc phải của quá trình đông máu :Các chất đông lưu hành .Các chất kháng đông lưu hành có 2 loại :kháng đông lupus và hiếm hơn là chất kháng 1 trong các yếu tố của đường nội sinh (điển hình là kháng yếu tố VIII do truyền nhiều trong bệnh Hemophilia)

-Các chất kháng đông lưu hành được phát hiện khi APTT kéo dài mà PT bình thường , điều này cho phép loại trừ sự bất thường trong hình thành fibrin.Sử dụng các tét đặc hiệu tiếp theo để xác định loại kháng đông hành. Lưu ý là các chất kháng đông lupus thường liên quan đến việc làm gia tăng nguy cơ huyết khối và chất kháng đông lưu hành đặc hiệu liên quan đến nguy cơ xuất huyết .Các thuốc thử APTT thương mại có thành phần khác nhau về số lượng và chất lượng sẽ có độ nhạy khác nhau với các bất thường này.

APTT kéo dài

PT kéo dài

Có Heparin trong mẫu không có Heparin trong mẫu

(TT dài, định lượng Heparin)

Test APTT trộn với huyết tương bình thường

APTT không điều chỉnh APTT được điều chỉnh

chất kháng đông lưu hành thiếu VIII,IX,XI,XII,PK,HMWK

kháng đông lupus kháng đông lưu hành đặc hiệu

1.4. PT và APTT kéo dài:

Bệnh nguyên của sự bất thường cả PT và APTT rất nhiều. Cần giải thích kết quả theo bệnh cảnh lâm sàng

- Nguyên nhân thường gặp:

+ Suy tế bào gan:

Làm giảm mức các yếu tố đông máu được tổng hợp ở gan, tỷ lệ với mức độ tổn thương gan. Riêng yếu tố VIII không phải được tổng hợp ở gan nên không giảm nhiều trong suy gan.

+ Điều trị kháng vitamin K hoặc bệnh lý gây giảm vitamin K:

Trong cả hai trường hợp, thường sự kéo dài PT nổi trội hơn và kết hợp giảm các yếu tố phụ thuộc vitamin K.

- Các nguyên nhân khác: Hiếm gặp hơn.

+ Đông máu rải rác trong lòng mạch( DIC ): Chẩn đoán về mặt sinh học khi bệnh cảnh lâm sàng gợi ý( phẫu thuật, bệnh lý sản khoa, nhiễm trùng máu, tân sinh, bỏng rộng,...) và kết hợp với các test khác: định lượng các yếu tố của phức hệ prothrombin và fibrinogen , số lượng tiểu cầu , sản phẩm thoái giáng của fibrinogen , fibrin(PDF, D-DIMER), phức hợp hòa tan ....

- Chẩn đoán sinh học của DIC dựa trên sự kết hợp của nhiều tiêu chuẩn.Sự lăp lại theo thời gian của các test rất có ích để đánh giá tiến triển của bệnh .Trong một số trường hợp hiếm hơn cần phân biệt giữa CIVD và tiêu fibrin tiên phát .

+Thiếu fibrinogen hay loạn fibrinogen maú

- Ngưỡng thiếu fibrinogen (<0,7g/l) có khả năng gây kéo dài TP và APTT . Ngược lại , tăng fibrinogen máu(>7g/l) cũng có thể gây kéo dài các test này do hiệu quả kháng thrombin của fibrinogen .Trong các trường hợp này, APTT thường bị rối loạn nhiều hơn .Trước một tình trạng giảm fibrinogen đơn độc , các đánh giá quá trình hình thành fibrin (PT, thời gian Reptilase) và do fibrinogen miễn dịch được thực hiện .Kểt quả của các test này giúp phân biệt những trường hợp rất hiếm của thiếu bẩm sinh số lượng fibrinogen (không có và giảm fibrinogen máu bẩm sinh )và những thiếu hụt về chất lượng (loạn fibrinogen máu ).

+ Thiếu hụt đơn thuần một trong các yếu tố của PT và APTT (ngoại trừ fibrinogen ).Thiếu hụt đơn độc yếu tố II,V và X rất hiếm , đó là những thiếu hụt hoặc bẩm sinh hoặc mắc phải (kháng đông lưu hành đặc hiệu )và có liên quan đến nguy cơ chảy máu .

+Các chất ức chế sự hình thành fibrin

Một số chất khánh đông lưu hành hiếm có thể gây kéo dài TT. Đó là nhũng kháng thể kháng thrombin hoặc kháng thể kháng fibrinogen . Những chất ức chế này liên quan đến nguy cơ xuất huyết và được tìm thấy trong cấc bệnh cảnh lâm sàng đặc biệt (loạn globulin máu) .Các sản phẩm thoái giáng fibrinogen xuất hiện nhiều gây ảnh hưởng đến sự hình thành fibrin và có thể làm kéo dài TT.

2. Nguy cơ huyết khối :

Khi APTT kéo dài , cần làm thêm :

- Khánh đông lupus

- Định lượng yếu tố XII

Tóm lại , nếu tuân thủ quy trình kiểm tra đông máu trước phẩu thuật sẽ hạn chế được các tai biến xảy ra do rối loạn đông máu trong và sau phẫu thuật .Tùy theo hoàn cảnh, điều kiện, tình trạng bệnh lý của bệnh nhân mà cân nhắc chỉ định xét nghiệm thích hợp .